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第六節 樣品處理與注意事項
一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分，是PCR的擴增模板。要進行PCR，研究DNA結構與功能或者用于診斷目的，首先必須從生物體內提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大(人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp)，提取DNA應盡量保持DNA完整性和純度，即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解，又要注意雜質及蛋白的去除，防止胞內酶解DNA。因此，提取DNA的基本過程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解細胞，消化蛋白質，使核蛋白解聚及胞內DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白質，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。
理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高，細胞經過熱變性使DNA釋出就可以作為模板，依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數很多的基因組，確實如此。但當待擴增的拷貝數甚少而無關細胞甚多時則擴增就不易成功，其原因是：①非希望的擴增增多，掩蓋了所需擴增的片段，使其數量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質會抑制PCR反應，最主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品，可以用滲透壓溶解紅細胞，離心集取細胞核，洗除血紅蛋白，再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之，使釋放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。
現將PCR前處理各種標本的基本方法介紹如下：
1.所需溶液
(1)PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0
(2)含表面活性劑及蛋白酶K的PCR緩沖液
50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2
0.1mg/ml明膠，0.45%NP40,0.45%吐溫20
高壓滅菌，冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。
(3)溶血緩沖液
0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5
5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100
2.提取方法
(1)用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法從血液或培養細胞分離的單核細胞(當PBC〈10%細胞數時用此程序)
①將細胞樣品用PBS稀釋至10ml，置15ml錐形離心管中;
②100×g離心2～5min，吸去上清;
③細胞再懸浮于10ml PBS中重新離心洗滌;
④沉淀物懸浮于溶液2中，使細胞濃度約為6×106/ml，移至1.5ml管中;
⑤50～60℃保溫1h;
⑥95℃保溫10min使蛋白酶變性;
⑦冷凍儲存。
如果RBC多于細胞的10%，則用PBS洗1次(步驟1，2)后，懸浮于1ml溶液3，并轉移至1.5ml離心管中，如程序B-2離心1次，再懸浮于溶液2中按程序A-4繼續進行。
(2)全血：此法使胞膜溶解故胞漿DNA丟失，約可得20μg DNA/0.5ml血。
①0.5ml全血與0.5ml溶液3共置1.5ml管中;
②13000×g離心20s;
③吸去上清，加1ml溶液3，旋渦混合使沉淀重新懸浮;
④重復第2，3步2次;
⑤13000×g離心2s，吸去上清，懸浮于0.5ml溶液2中;
⑥按程序A5～7步進行。
(3)拭子
①用PBS預溫的試子從宮頸、陰道或陰莖采樣;
②拭子置入2ml PBS(含抗霉劑)于15ml離心管中，室溫可保存24h，置4℃可保存更長時間。也可用旋渦混合器振蕩使細胞加速游離;
③取去拭子，2000～13000×g離心5min，吸去上清;
④如含RBC則加1ml溶液3，轉移至1.5ml E管中，按程序B-2開始進行;
⑤如不含RBC則加溶液2，按程序A-4進行。
(4)頭發
①拔下頭發，剪下頭發近端0.5cm段;
②置入0.4ml溶液2中(1.5ml管);
③按程序A5～7步進行，用50μl體系作PCR。
(5)血細胞RNA用焦碳酸二乙酯(DEP)抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。
①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分離單核細胞;
②置2ml離心管中，加PBS至細胞中，500×g離心5min;
③配制(DEP)溶液用無水乙醇將DEP作9+1稀釋，再用NP-400.5%作1：999稀釋(抑制RNase);
④細胞沉淀中加200～400μl此溶液，旋渦混合;
⑤13000×g離心10s;
⑥上清轉移至新管中，37℃保溫20min，90℃，10min;
⑦離心，上清轉移至新管。取5～10μl作反轉錄;
⑧如果反轉錄失敗，可能因DEP殘留，可將樣品再在90℃加熱5min，再做試驗;
⑨本法也可用于培養細胞。
二、注意事項
PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這是造成假陽性最大的可能。下例可形象說明污染的嚴重性。
典型的PCR反應可在100μl反應液中擴增1012個DNA，此液傾入50nm×25m×2m的游泳池中，充分混合取0.1ml池水,其中含有40個分子的DNA,用PCR擴增即已可呈陽性，這一點對檢測HIV更為重要。常規只要15個拷貝的核酸即可查出。假陽性結果往往來自痕量污染和交叉污染，尤其在待擴增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。
(1)DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理，常規消耗用品用后作一次性處理，避免反復使用造成污染。
(2)PCR在超凈臺內進行，操作前后紫外燈消毒。
超凈臺內設內供PCR用微量離心機、一次性手套、整套移液器和其它必須品;移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
(3)PCR操作應戴手套并勤于更換。
(4)成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。
(5)試劑管用前先瞬時離心(10s)，使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。
(6)最后加模板DNA(包括在石蠟油后)，馬上蓋好，混勻，瞬時離心(10s)，使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。
(7)實驗設陽性、陰性對照。
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